SCIENZE BIOMOLECOLARI, GENOMICHE E CELLULARI

Ex laurea magistrale in Biologia Molecolare

BIOLOGIA STRUTTURALE

Docenti: 
LUISI BONAVENTURA FRANCESCO
Crediti: 
6
Sede: 
PARMA
Anno accademico di offerta: 
2020/2021
Responsabile della didattica: 
Settore scientifico disciplinare: 
BIOLOGIA MOLECOLARE (BIO/11)
Semestre dell'insegnamento: 
Secondo Semestre
Lingua di insegnamento: 

Italiano e Inglese

Obiettivi formativi

CONOSCENZA E COMPRENSIONE
L’obiettivo principale del corso è quello di fornire allo studente gli strumenti necessari per un'analisi dettagliata e critica della struttura delle proteine e dei loro complessi macromolecolari. La prima parte del corso è dedicata alla comprensione delle proprietà chimico-fisiche degli amminoacidi che sono alla base della struttura delle proteine. Gli argomenti trattati durante le lezioni frontali saranno oggetto di prove pratiche individuali svolte al computer con cui gli studenti si cimenteranno con l’analisi strutturale di proteine modello.

CAPACITA' DI APPLICARE CONOSCENZA E COMPRENSIONE
L'obiettivo didattico consiste nel conseguimento delle conoscenze necessarie per un'analisi critica della struttura delle proteine e degli acidi nucleici. Al termine del corso gli studenti avranno acquisito le competenze necessarie per affrontare l'analisi e lo studio sperimentale di macromolecole biologiche. In particolare lo studente sarà in grado di ottenere le coordinate di proteine ed acidi nucleici dalla banca dati PDB, riconoscerne il folding e utilizzare software per un'analisi critica della struttura tridimensionale.

AUTONOMIA DI GIUDIZIO
Il corso è finalizzato ad accrescere la capacità di analizzare in chiave critica le interazioni che sono alla base della struttura tridimensionale delle proteine e degli acidi nucleici.

ABILITA' COMUNICATIVE
L'articolazione del corso prevede una notevole attività di discussione in aula tesa a sviluppare l'attitudine degli studenti a trasmettere le competenze scientifiche acquisite a supporto delle proprie argomentazioni. In sede di esame lo studente dovrà sostenere una presentazione orale relativa alla determinazione della struttura di proteine e acidi nucleici mediante microscopia elettronica CryoEM.

CAPACITA' DI APPRENDIMENTO
Le continue evoluzioni della ricerca scientifica ed in particolare della biologia molecolare e strutturale richiedono un aggiornamento continuo delle competenze. Per tale motivo, il corso si prefigge di fornire l'autonomia necessaria per il conseguimento di una più ampia conoscenza e per l'allineamento delle competenze agli avanzamenti della ricerca in campo biologico.

Contenuti dell'insegnamento

Gli aminoacidi
Legame peptidico
Struttura secondaria
Struttura terziaria
Struttura quaternaria
Folding delle proteine
Enzimi
Interazione DNA-proteina
Proteine di membrana
Proteine Fibrose
Determinazione della struttura di proteine e acidi nucleici mediante CryoEM

Programma esteso

Proprietà fisico-chimiche degli aminoacidi.

Organizzazione del codice genetico.

Reazioni chimiche coinvolte nella sintesi delle proteine.

Il legame peptidico, angolo di rotazione phi e psi, il diagramma di Ramachandran.

Strutture secondarie: Eliche alfa, 3.10 e pi greco, foglietti beta, regioni loop.

Diagrammi topologici, motivi elica-giro-elica leganti il calcio, forcine beta, motivo a greca, motivo beta-alfa-beta.

Strutture ad alfa elica: contatti inter-elica e organizzazione superstrutturale di proteine ad alfa-elica, fascio di quattro eliche, il folding delle globine.

Strutture alfa-beta: struttura a botte TIM, ripiegamento di Rossmann.

Strutture beta: "barili" formati da filamenti beta antiparalleli; motivo a chiave greca; "jelly roll" (proteine leganti la vitamina A; neuraminidasi; gamma-cristallina; immunoglobuline e proteine immunoglobulina-simili.

Il folding delle proteine: flessibilità conformazionale, fattori termodinamici e cinetici che influenzano il folding, isomerizzazione dei residui di prolina, struttura e funzione delle chaperonine GroEL/GroES.

Proteine con attività enzimatica: Le serina proteasi, Cisteina proteasi, Aspartato proteasi, Metalloproteasi, il complesso enzima-substrato, Km, Kcat, Vmax, lo stato di transizione, meccanismo d'azione della chimotripsina, specificità, evoluzione convergente.

Modificazioni post-traduzionali delle proteine: fosforilazione, acetilazione, glicosilazione, metilazione, ubiquitinazione, lipidazione.

Struttura del DNA.

Riconoscimento del DNA da parte di fattori di trascrizione procariotici: il motivo elica giro elica, interazioni specifiche e non-specifiche, Cro, repressore di lambda, repressore dell'operone Lac, CAP, repressore del triptofano, effettori allosterici che alterano l'affinità della proteina per il DNA.

Riconoscimento del DNA da parte di fattori di trascrizione eucariotici: la TBP, interazioni sequenza specifiche, idrofobiche e plasticità del DNA, le proteine a omeodominio, le regioni POU. Motivi Zinc finger, la cerniera a leucina del GCN4.

Proteine di membrana: la batteriorodopsina, le porine, il canale del potassio, grafici di idropatia, canali ionici Cys-loop.

Struttura della F1F0 ATPasi.

Proteine fibrose: alfa cheratine, collageno, fibroina.

AN INTRODUCTION TO ELECTRON CRYO MICROSCOPY FOR BIOLOGICAL MOLECULES

The aim of the lectures and workshop is to explore the principles of electron cryo microscopy and to understand how the method has grown over the decades to become such a powerfully effective tool for determining the three dimensional structures of biological macromolecules at high resolution. The course will cover topics including sample preparation, data collection and processing, three dimensional image reconstruction, and model generation and validation. We will also discuss developments of electron microscopy, including applications in drug discovery and tomography. We will go through a tutorial to prepare a three dimensional map from experimental data.

I. Background to transmission electron microscopy and image formation.
Why choose electrons? Comparison of interactions of X-ray and electrons with biological molecules. Electron Optics. Amplitude and phase objects. Elastic scatter versus inelastic and radiation damage. Phase contrast in cryo-TEM image formation. Contrast transfer and Contrast transfer function (CTF) correction.

II. Methods to prepare grids for TEM
Sample preparations for TEM: Negative-stained EM and cryo-EM. Sample delivery methods.

III. Basic theory for 3D reconstitutions
3D reconstruction from 2D projections.

IV. Cryo-EM data collection, data processing, map validation and methods for model building and refinement
Optimization of signal on the detector: principles of direct electron detectors. The electron microscope as an interferometer: coherence and defocus – why these are important to achieve maximum resolution. Optimization of dose to minimize sample damage.
Will cryoEM become cheaper and more democratic? Development of economic detectors and 100 keV machines.
Maximum-likelihood (ML) for image alignment and classification (RELION). Beam induced movement and correction. Map validation: Fourier shell correlation (FSC).
Model building and refinement. Focused classification. 3D variation analysis.

V. The future of cell biology: cryo-tomography
Preparing samples for tomography by milling. Specimen tilting, energy filtering. Sub-tomogram averaging. Correlative microscopy.

Resources:

Videos

An excellent general overview by Yifan Cheng, UCSF https://www.ibiology.org/ibioseminars/single-particle-cryo-em.html
“Getting Started in Cryo-EM” with Professor Grant Jensen at the California Institute of Technology. Video lectures recorded by Prof Grant Jensen, available on YouTube: http://cryo-em-course.caltech.edu/

Excellent introductory lecture series on cryoEM at the MRC LMB, 2017

https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/research/scientific-training/electron- microscopy/

Publications

Methods in Enzymology vol 579, The resolution revolution: recent advances in cryoEM, edited by Tony Crowther.

Henderson R. Realizing the potential of electron cryo-microscopy. Q Rev Biophys. 2004 37:3-13.

Scheres, S.H.W. A Bayesian view on cryo-EM structure determination. 2012. Journal Molecular Biology 415, 406-418.

Baker and Henderson (2012), Int. Tables for Cryst., Vol. F, p. 451-463. https://bakerlab.ucsd.edu/publication-pdfs/2012-Baker-Henderson_IT- F_593.pdf

Passmore, L.A. and Russo, J.C. Specimen preparation for high-resolution cryo- EM. Methods Enzymol. 2016; 579: 51–86. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5140023/

Frank, J. (2006) Three-Dimensional Electron Microscopy of Macromolecular Assemblies: Visualization of Biological Molecules in Their Native State, OUP

Bibliografia

Branden C., Tooze J. INTRODUZIONE ALLA STRUTTURA DELLE PROTEINE (Zanichelli, II Ed., 2001)

Petsko, G.A., Ringe D., STRUTTURA E FUNZIONE DELLE PROTEINE (Zanichelli, 2006).

Nelson D.L., Cox M.M. I PRINCIPI DI BIOCHIMICA DI LEHNINGER (Zanichelli, III ed., 2002)

David Whitford, PROTEINS STRUCTURE AND FUNCTION (Wiley)
http://books.google.it/books?id=qbHLkxbXY4YC

Metodi didattici

Il corso si compone di lezioni online in cui verranno presentati i principali argomenti previsti dal programma e da una parte teorica e pratica con esercitazioni al computer in cui gli studenti impareranno a determinare ed analizzare la struttura di proteine e acidi nucleici mediante CryoEM. Oltre ai libri di testo, gli studenti hanno a disposizione sul sito web del corso materiale didattico tra cui le slide utilizzate a lezioni ed articoli scientifici messi a disposizione dal docente.

Modalità verifica apprendimento

Per l’anno accademico corrente, si prevede che le conoscenze acquisite, nonché la capacità di utilizzarle in pratica, saranno verificate nel corso di una prova orale. Finché perdurerà l'emergenza COVID-19, la prova verrà svolta in modalità telematica. Durante tale esame orale, gli studenti saranno invitati a descrivere in modo approfondito specifici argomenti trattati nel corso e a dimostrare le capacità acquisite relativamente alla parte teorica e tecnica di determinazione della struttura di proteine e acidi nucleici mediante CryoEM (il che servirà a valutare la conoscenza acquisita e la comprensione della materia). Ciò servirà a valutare la capacità di applicare la conoscenza e la comprensione, nonché l'autonomia di giudizio e la capacità di comunicare idee e concetti con chiarezza e proprietà del linguaggio.
Il voto finale (scala 18-30) deriverà da una valutazione bilanciata dei diversi aspetti menzionati. La lode verrà assegnata in caso di studenti che evidenzino una eccellente conoscenza e comprensione della materia, ottima capacità di applicarle, buona autonomia di giudizio e padronanza del lessico disciplinare.

Altre informazioni

Orario delle lezioni, materiale didattico, appelli sono consultabili al sito web:
https://elly.scvsa.unipr.it